DAGE-MTI HR120 User Manual

Aus dem CharitéCentrum für Chirurgische Medizin Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie (Direktor: Prof. Dr. med. P. Neuhaus)

Inhaltsverzeichnis 10 Abkürzung oder Symbol Definition Iv Lichtintensität der Venole IL-1α Interleukin-1α IL-6 Interleukin-6 IPC Ischämische Pr

Zusammenfassung 100 Überlebensrate hingegen nicht. Die vermehrte Adhäsion der Thrombozyten an der Gefäßwand der postkapillären Venolen in der frü

Danksagung 101 7 DANKSAGUNG Meinem Lehrer, Herrn Prof. Dr. med. P. Neuhaus, Direktor der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschi

Danksagung 102 Der Weg zur Habilitation führte über eine solide chirurgische Ausbildung, die ich dankenswerter Weise erfahren durfte. Stellvertre

Literaturverzeichnis 103 8 LITERATURVERZEICHNIS Abbracchio MP, Brambilla R, Ceruti S, Kim HO, von Lubitz DK, Jacobson KA, Cattabeni F: G protein-

Literaturverzeichnis 104 undergoing heart transplantation, interaction with tnfalpha and potential role in myocardial cell death. J Mol Cell Card

Literaturverzeichnis 105 Brake AJ, Julius D: Signaling by extracellular nucleotides. Annu Rev Cell Dev Biol 1996; 12: 519-541 Braun N, Sevigny J,

Literaturverzeichnis 106 interactions induced by intestinal ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003; 284: G1027-1033 C

Literaturverzeichnis 107 Del Conde I, Cruz MA, Zhang H, Lopez JA, Afshar-Kharghan V: Platelet activation leads to activation and propagation of t

Literaturverzeichnis 108 Physiol Pharmacol 2003; 81: 212-219 Dwyer KM, Robson SC, Nandurkar HH, Campbell DJ, Gock H, Murray-Segal LJ, Fisicaro N,

Literaturverzeichnis 109 and albumin in the canine aortic wall. Am J Physiol 1977; 233: H66-79 Gaarder A, Jonsen J, Laland S, Hellem A, Owren PA:

Einleitung 11 1 EINLEITUNG 1.1 NUKLEOTIDE UND PURINERGE REZEPTOREN 1.1.1 Nukleotide Die Bezeichnung Nukleotid geht auf die Erstbeschreibung des N

Literaturverzeichnis 110 Hou M, Moller S, Edvinsson L, Erlinge D: Cytokines induce upregulation of vascular p2y(2) receptors and increased mitoge

Literaturverzeichnis 111 Kaczmarek E, Koziak K, Sevigny J, Siegel JB, Anrather J, Beaudoin AR, Bach FH, Robson SC: Identification and characteriz

Literaturverzeichnis 112 Kittel A, Kiss AL, Mullner N, Matko I, Sperlagh B: Expression of ntpdase1 and caveolins in human cardiovascular disease.

Literaturverzeichnis 113 nucleotidase) in mouse microvessel endothelial cell lines. Microvasc Res 2006; Lu CY, Penfield JG, Kielar ML, Vazquez M

Literaturverzeichnis 114 Miescher F: Ueber die chemische zusammensetzung der eiterzellen. Med-Chem Untersuch 1871; 4: 441-460 Milazzo VJ, Ferrant

Literaturverzeichnis 115 Surg 1969; 57: 225-229 Packham MA, Mustard JF: Platelet aggregation and adenosine diphosphate/adenosine triphosphate rec

Literaturverzeichnis 116 FH: Loss of atp diphosphohydrolase activity with endothelial cell activation. J Exp Med 1997; 185: 153-163 Robson SC, Sc

Literaturverzeichnis 117 Biochim Biophys Acta 1997; 1334: 73-88 Sevigny J, Sundberg C, Braun N, Guckelberger O, Csizmadia E, Qawi I, Imai M, Zimm

Literaturverzeichnis 118 Thomson LF, Ruedi JM, Glass A, Moldenhauer G, Moller P, Low MG, Klemens MR, Massaia M, Lucas AH: Production and characte

Literaturverzeichnis 119 of cytoplasmic calcium. J Clin Invest 1987; 80: 267-271 Wu MH: Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physi

Einleitung 12 Des weiteren haben Adenosinnukleotide eine Bedeutung als Komponenten gruppen- oder wasserstoffübertragender Koenzyme (Koenzym A, Fl

Erklärung 120 9 ERKLÄRUNG § 4 Abs. 3 (k) der HabOMed der Charité Hiermit erkläre ich, dass • weder früher noch gleichzeitig ein Habilitationsv

Einleitung 13 Physiologische Aktivitäten extrazellulärer Adeninderivate (Abbildung 1) wurden erstmals 1929 von Drury und Szent-Györgyi beschriebe

Einleitung 14 Außerdem werden hohe Nukleotidkonzentrationen im Rahmen von Zelllysen (Nekrose) freigesetzt [Boeynaems et al., 2005]. 1.1.2 Purine

Einleitung 15 Die P2-Rezeptoren werden aufgrund ihrer molekularen Struktur und dem Mechanismus der Signaltransduktion in zwei Familien, P2X und

Einleitung 16 Kalzium-Ionen (Ca2+) hingegen unterscheidet sich erheblich zwischen den einzelnen Subtypen. Während P2X1- und P2X3-Rezeptoren unter

Einleitung 17 Die Familie der metabotropen P2Y-Rezeptoren besteht dagegen ebenfalls aus G-Protein-gekoppelten, transmembranösen Proteinen, von de

Einleitung 18 Viele Zellen exprimieren mehrere P2Y-Subtypen. Die Stimulation rekombinanter P2Y-Rezeptoren aktiviert entweder die Phospholipase C

Einleitung 19 Vorkommen zeigen [Zimmermann, 2000]. Die katalytisch aktiven Abschnitte der plasmamembranständigen Ekto-Nukleotidasen sind in den E

Für Anna Philine

Einleitung 20 Abbildung 2: Familie der plasmamembranständigen Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolasen (NTPDase). In Klammern sind die

Einleitung 21 1.2.4 Vaskuläre Ekto-Nukleotidasen CD39 wurde ursprünglich als Aktivierungsmarker von Natural-Killer-Zellen, B-Zellen und Subpopula

Einleitung 22 1.3 CD39-AKTIVITÄT UND THROMBOGENESE 1.3.1 Physiologische Thromboregulation Das ruhende Endothel bildet die antithrombotische Oberf

Einleitung 23 Abbildung 4: CD39 und Thromboregulation. Verschiedenste Noxen, sei es durch toxische oder mechanische Schädigung, führen zu eine

Einleitung 24 1.3.2 Ischämie und Reperfusion Die Transplantation solider Organe ist obligat mit kalter und warmer Ischämie verbunden, die von der

Einleitung 25 1.3.3 Organtransplantation Ischämie, Reperfusion und Konservierung eines Organtransplantates traumatisieren zunächst das vaskuläre

Einleitung 26 Spenderorgane von cd39-null Mäusen hingegen zeigten im verzögerten Abstoßungsmodell signifikant verkürzte Überlebenszeiten im Vergl

Einleitung 27 intrazellulärem ATP, die von einer steigenden Interleukin-1α-Konzentration im Zellüberstand gefolgt wird [Imai et al., 2000a]. Die

Einleitung 28 Rekonstitution der Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo. Auf eine prothrombotische Störung der Endothelzellfunktion in cd39-nu

Einleitung 29 1.5 HYPOTHESE UND FRAGESTELLUNG Die im Folgenden dargestellten und zu untersuchenden Hypothesen beschreiben die Bedeutung der vasku

Inhaltsverzeichnis 3 0 INHALTSVERZEICHNIS 0 Inhaltsverzeichnis 3 0.1 Abbildungen 6 0.2 Tabellen 8 0.3 Abkürzungen und Symbole 9 1 Einleitu

Material und Methoden 30 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 TIERMODELLE 2.1.1 Tiere und Tierhaltung Alle Tiere wurden in einer pathogenfreien, durch die

Material und Methoden 31 2.1.2 Modell der intestinalen Ischämie Vor der chirurgischen Intervention wurden die Mäuse einer nächtlichen Fastenperio

Material und Methoden 32 Gummiband um die Basis der verbliebenen Leberlappen geschlungen. Die Okklusion des rechten und linken Pedikels des Lobus

Material und Methoden 33 2.1.4 Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation Die heterotope Transplantation der murinen Spenderherzen in

Material und Methoden 34 Im Rejektionsmodell der xenogenen Transplantation erhalten die Empfängertiere keine Vorbehandlung und im Verlauf keine I

Material und Methoden 35 2.1.5 Modell der akuten toxischen Hepatitis Zur Induktion der akuten toxischen Hepatitis wurden Wildtyp-Mäuse nach dem v

Material und Methoden 36 2.2.2 Adenosin/Amrinon Die Applikation von Adenosin erfolgt mittels einer kontinuierlichen Infusion und wird mit der Gab

Material und Methoden 37 2.3 ÜBERLEBENSSTUDIEN In den Überlebensstudien wurden die operierten Tiere nach 60-minütiger intestinaler (siehe 2.1.2)

Material und Methoden 38 2.4 INTRAVITALE VIDEOMIKROSKOPIE 2.4.1 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen Die Fluoreszenzmarkierung der Spenderthro

Material und Methoden 39 Quecksilberlampe (HB-1010 AF, Nikon) und den passenden Exzitations-Emissions-Filtern bestückt. Die Aufnahme der mikrosko

Inhaltsverzeichnis 4 2.3 Überlebensstudien 37 2.4 Intravitale Videomikroskopie 38 2.4.1 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen 38 2.4.2 In

Material und Methoden 40 Die Klassifikation der Interaktionen der markierten Thrombozyten mit dem Endothel erfolgte nach der von S. Massberg ange

Material und Methoden 41 100 Watt Quecksilberlampe (HBO100, Zeiss) und einem passenden Exzitations-Emissions-Filterset ausgestattet. Die Aufnahme

Material und Methoden 42 Untersucht wurden Wildtyp- und cd39-null Mäuse in der Reperfusionsphase nach 45-minütiger Okklusion der Arteria mesenter

Material und Methoden 43 (optische Dichte, OD) pro g Probengewicht. Neben den ischämen und scheinoperierten Wildtyp- und cd39-null Versuchstieren

Material und Methoden 44 2.6 SERUM- UND GEWEBEPROBEN 2.6.1 Probengewinnung Die Gewinnung der Serum- und Gewebeproben erfolgte unmittelbar vor Fre

Material und Methoden 45 Die Bestimmung der VEGF-Konzentration erfolgte in nativen Wildtyp- und cd39-null Mäusen (n=3 je Gruppe). 2.6.3 Myeloper

Material und Methoden 46 2.6.4 NTPDase-Aktivität Die Enzymaktivität der schockgefrorenen Mausgewebe wurde nach den von J. Sévigny [Sevigny et al.

Material und Methoden 47 Die NTPDase-Aktivität wurde in folgenden Studiengruppen bestimmt: 1. Native Gewebe (Gehirn, Lunge, Herz, Leber, Pankrea

Material und Methoden 48 2.7 ENDOTHELZELL-AKTIVIERUNG DURCH NUKLEOTIDE Humane aus Umbilikalvenen isolierte Endothelzellen (HUVEC) wurden von Camb

Ergebnisse 49 3 ERGEBNISSE 3.1 NTPDase-AKTIVITÄT IN MURINEN GEWEBEN 3.1.1 Native Mausgewebe Die gesamte NTPDase-Aktivität der untersuchten Protei

Inhaltsverzeichnis 5 4.3 Bedeutung der NTPDase 1 für die hepatische Ischämietoleranz 88 4.4 Bedeutung der vaskulären NTPDase für den intestinal

Ergebnisse 50 Gehirn020406080100120140160180ATP ADPSubstratNTPDase-Aktivität[nmol Pi/mg/min]cd39 +/+cd39 -/-*** Abbildung 10: NTPDase-Aktivität

Ergebnisse 51 Native Herzen zeigten mit dem Substrat ATP die höchste NTPDase-Aktivität aller untersuchten Organe mit einer hohen Substratspezifit

Ergebnisse 52 Wurde die Aktivität der alkalischen Phosphatase durch die Zugabe von Tetramisol gehemmt, so verringerte sich die NTPDase-Aktivität

Ergebnisse 53 Pankreas020406080100120140160ATP ADPSubstratNTPDase-Aktivität[nmol Pi/mg/min]cd39 +/+cd39 +/-cd39 -/-***# Abbildung 14: NTPDase-A

Ergebnisse 54 Die NTPDase-Aktivität der Niere zeigte eine Substratspezifität für ATP, die sich in den cd39-null Organen nahezu unverändert darste

Ergebnisse 55 Jejunum050100150200250300ATP ADPSubstratNTPDase-Aktivität[nmol Pi/mg/min]cd39 +/+cd39 -/-*** Abbildung 16: NTPDase-Aktivität des

Ergebnisse 56 3.1.2 Intestinale Ischämie Wildtyp Mäuse wurden einer 60-minütigen intestinalen Ischämie oder einer Scheinoperation unterzogen. Die

Ergebnisse 57 Umgekehrt führte die Behandlung der ischämen Tiere vor Reperfusion mit einer Einmaldosis löslicher NTPDase zu keiner messbaren Erhö

Ergebnisse 58 min, p=0,033 vs. IRI 0’; ADP: 38,85 ± 2,93 nmol Pi / mg / min, p=0,030 vs. IRI 0’). 60 Minuten nach Reperfusion fand sich eine voll

Ergebnisse 59 Im Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation (xCTX) zeigten die a Xenogene Herztransplantation - ATP0501001502002500 1

Inhaltsverzeichnis 6 0.1 ABBILDUNGEN Nummer Titel der Abbildung Seite 1 Chemische Struktur der Adenosinnukleotide 12 2 Familie der plasmame

Ergebnisse 60 3.1.4 Akute toxische Hepatitis Im Modell der akuten toxischen Hepatitis fand sich in den Lebern 24 Stunden nach Sensibilisierung m

Ergebnisse 61 a CD39-Gentransfer Jejunum - ATP01002003004000 1,0E+09 5,0E+09 1,0E+10 5,0E+10rCD39Ad [PFU]NTPDase-Aktivität[nmol Pi/mg/min] b CD

Ergebnisse 62 3.1.5 Adenoviraler CD39-Gentransfer Die intravenöse Injektion der rekombinanten CD39-Adenoviren (rCD39Ad) führte entgegen der Erwar

Ergebnisse 63 3.2 ÜBERLEBENSRATEN IN DEN ISCHÄMIE-REPERFUSIONS-MODELLEN 3.2.1 Modell der hepatischen Ischämie 92 % der Wildtyp-Mäuse überlebten d

Ergebnisse 64 a d b e c f Abbildung 24: Postmortale Befunde nach hepatischer Ischämie. In der Abbildung sind repräsentativepos

Ergebnisse 65 Sowohl durch Substitution mit löslicher NTPDase als auch durch Supplementation mit Adenosin und Amrinon ließ sich in den cd39-heter

Ergebnisse 66 Nach adenoviralem A20-Gentransfer zeigten die cd39-null Mäuse eine signifikant verlängerte Überlebenszeit gegenüber ihren Kontrolle

Ergebnisse 67 3.2.2 Modell der intestinalen Ischämie 60 % aller Wildtyp-Mäuse starben innerhalb von 24 Stunden nach der 60-minütigen intestinalen

Ergebnisse 68 Repräsentative histologische Befunde sind in Abbildung 28 wiedergegeben und zeigten eine Stunde nach Reperfusion erhebliche Störun

Ergebnisse 69 den nativen Wildtyp-Kontrollen mit segmentalem Verlust des Epithels sowie beträchtlichen Einblutungen. Die apyrasebehandelten Tiere

Inhaltsverzeichnis 7 Nummer Titel der Abbildung Seite 22 NTPDase-Aktivität des Jejunums nach adenoviralem CD39-Gentransfer 61 23 Überleben d

Ergebnisse 70 Die nativen cd39-null Mäuse zeigten unmittelbar nach Freigabe der SMA erhebliche intestinale Blutungen und 80 % der Versuchstiere v

Ergebnisse 71 Die postmortalen Befunde zeigten ausschließlich in den unbehandelten cd39-null Tieren einen signifikanten intestinalen Blutverlust.

Ergebnisse 72 Die cd39-null Mäuse zeigten nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior instabile Kreislaufverhältnisse und wurden

Ergebnisse 73 3.4 KAPILLARLECK NACH INTESTINALER ISCHÄMIE 3.4.1 Intravitale Videomikroskopie Die Sequestration des fluoreszenzmarkierten Albumins

Ergebnisse 74 Unmittelbar nach Freigabe des Blutstromes nach 45-minütiger intestinaler Ischämie (IR) zeigten die cd39-null Tiere bei stabilem Kre

Ergebnisse 75 Gefäßpermeabilität0102030405060Kontrolle Sham Vehikel NTPDase Adenosin/AmrinonEvans Blue Akkumulation [OD/g]cd39+/+cd39-/-* **°#

Ergebnisse 76 3.5 SERUM- UND GEWEBEMARKER 3.5.1 Zytokine nach intestinaler Ischämie Wildtyp-Mäuse zeigten eine Stunde nach Freigabe des Blutstrom

Ergebnisse 77 Tieren (1889,0 ± 1039,53 pg/ml vs. 189,5 ± 1,74 pg/ml, p=0,089, Abbildung 35). Jeder einzelne Messwert der mit dem Vehikel behande

Ergebnisse 78 3.5.2 Myeloperoxidase-Aktivität nach intestinaler Ischämie In der Reperfusionphase nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesente

Ergebnisse 79 3.5.3 Vascular-Endothelial-Growth-Factor Die Serumkonzentrationen des VEGF in nativen Wildtyp- und cd39-null Mäusen zeigten mit 74

Inhaltsverzeichnis 8 0.2 TABELLEN Nummer Titel der Tabelle Seite 1 Zelluläre Mechanismen und pathophysiologischer Kontext der Freisetzung von

Ergebnisse 80 3.6 ENDOTHELZELL-AKTIVIERUNG DURCH NUKLEOTIDE Die Stimulation der kultivierten HUVEC mit ATP oder UTP führte zu einer deutlichen Ve

Ergebnisse 81 a b c d Abbildung 38: Veränderungen des Zytoskeletts durch Nukleotid-Stimulation. Fluoreszenzmiskoskopiehumaner aus Um

Diskussion 82 4 DISKUSSION 4.1 NTPDase-AKTIVITÄT IN NATIVEN ORGANEN Den biologischen Funktionen der Organe entsprechend weist die gesamte Nukleot

Diskussion 83 Neben der Lokalisation im Gefäßsystem finden sich auch in den spezifischen Kompartimenten der Organe signifikante NTPDase-Aktivität

Diskussion 84 Nukleotide hydrolisiert [Bigonnesse et al., 2004; Knowles,Li, 2006]. Die physiologische Bedeutung und Lokalisation in der Leber ver

Diskussion 85 Untersuchungen zeigten unter hypoxischen Bedingungen einen erheblich gesteigerten epithelialen cd39-mRNA-Nachweis, der mit einer v

Diskussion 86 Aktivität. Im Modell der akuten toxischen Hepatitis wird die erwartete Verminderung der globalen hepatischen NTPDase-Aktivität 24 S

Diskussion 87 wurde [Tanaka et al., 2004]. Somit kommt der vaskulären NTPDase-Aktivität eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie des Ischämie-

Diskussion 88 Allerdings bedingte die erhebliche Überexpression der NTPDase 1 in den infizierten Mäusen eine signifikante Reduktion der ATP-Plasm

Diskussion 89 identifiziert [Serracino-Inglott et al., 2002; Carini,Albano, 2003; Koti et al., 2003; Teoh,Farrell, 2003]. Durch die Exposition ge

Inhaltsverzeichnis 9 0.3 ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE Abkürzung oder Symbol Definition 5’-NT 5’-Nukleotidase ADP Adenosindiphosphat AMP Adenosinmonop

Diskussion 90 löslicher NTPDase vor Freigabe des Blutstromes führt bei den Wildtyp-Versuchstieren zu einer Ischämietoleranz, mit dem Erhalt der v

Diskussion 91 angesehen werden und geht mit einer verminderten postischämen Zytokinfreisetzung (TNF-α und IL-1α) im Vergleich zu den Kontrollen e

Diskussion 92 Minuten nach Freigabe des Blutstromes, werden präformierte Adhäsionsmoleküle aus den Weibel-Palade-Körpern an der Oberfläche der En

Diskussion 93 und die hier vorgestellten Daten beschreiben nach Stimulation mit ATP ebenfalls eine Änderung der Zellarchitektur. Die Substitution

Diskussion 94 Konservierungsschaden und fortgesetzten immunologischen Insulten zeigt sich eine erheblich verzögerte Rekonstitution der NTPDase-Ak

Diskussion 95 einem Thromboemboliemodell überprüft [Haller et al., 2006]. Außer in den zitierten Ischämie-Reperfusions- und Transplantationsmodel

Schlussfolgerungen 96 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN Ausgehend von den formulierten Hypothesen und Fragestellungen (siehe 1.5) lassen sich die Bedeutung de

Schlussfolgerungen 97 7. Vergleichbare Effekte der pharmakologischen Applikation löslicher NTPDasen lassen sich sowohl für die Transplantation al

Zusammenfassung 98 6 ZUSAMMENFASSUNG Die Nukleotide Adenosintriphosphat (ATP) und –diphosphat (ADP) sowie das Adenosin selbst wurden in der Mitte

Zusammenfassung 99 Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, den quantitativen Anteil der NTPDase 1 an der globalen Nukleotidase-Aktivität durch